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桶裝水中銅綠假單胞菌檢測及控制

發(fā)布時間：2021-04-16點擊量： 1134作者：陜西欣諾華生物

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種重要的水源性條件致病菌，廣泛存在于各類型水中，欣諾華生物工程師提示大家，因為對消毒劑、干燥、紫外線燈理化因素具有較強(qiáng)的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病。近年來，銅綠假單胞菌污染桶裝水的情況報道較多，是市面上包裝飲用水zui容易出現(xiàn)的質(zhì)量問題；2018年山東、江蘇、貴州、廣東等多省市瓶（桶）裝飲用水不合格率高發(fā)，主因是銅綠假單胞菌超標(biāo)嚴(yán)重，該項目政府抽檢不合格率遠(yuǎn)超其他抽檢項目，質(zhì)量安全問題十分嚴(yán)重，主要原因是生產(chǎn)企業(yè)沒有做好日常生產(chǎn)過程的微生物監(jiān)控，生產(chǎn)過程的消毒效果缺乏準(zhǔn)確的驗證方法，使得生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量失控。

根據(jù)GB8538-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗方法是國家zui新公布的針對包裝飲用水銅綠假單胞菌的檢驗方法，檢驗程序如下：

標(biāo)準(zhǔn)的檢測過程寫的比較精煉，對于一般生產(chǎn)企業(yè)的檢測人員來說在實際的檢測過程中，會遇到比較多的問題，以下來對其中的可能的檢測難點一一說明并推薦相應(yīng)的解決辦法。

具體操作步驟

1 水樣過濾

取好的水樣需在100級的潔凈工作臺用0.45um的濾膜進(jìn)行抽濾，將微生物截留在濾膜上，再將濾膜貼在CN瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)避免在濾膜和培養(yǎng)基之間夾留氣泡。

這個步驟中有兩個方面檢測方法中未說明，一是采用何種濾器和如何滅菌，二是濾膜如何滅菌。

包裝水生產(chǎn)企業(yè)可以購買專用的多聯(lián)不銹鋼過濾系統(tǒng)，一般材質(zhì)是不銹鋼的，可以用牛皮紙包好后直接放入滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行滅菌；也可以購買常見的砂芯過濾器，同樣可以用牛皮紙包好后放入滅菌鍋滅菌；如果需要使用的濾器數(shù)量較多，可以采用高溫火焰噴槍灼燒方式滅菌，也可起到滅菌效果。濾膜可采用一次性無菌濾膜。

多聯(lián)不銹鋼過濾系統(tǒng)

無菌濾膜

無菌微孔濾膜

2 濾膜在CN瓊脂培養(yǎng)和觀察

CN瓊脂培養(yǎng)后的菌落形態(tài)分以下三種，其它情況為非銅綠假單胞菌：

（1）藍(lán)色或綠色的典型可疑菌落，直接做綠膿菌素的確證性實驗，這個現(xiàn)象比較明顯，也容易辨認(rèn)；

CN培養(yǎng)基上綠色菌落

綠膿菌素確證

（2）非藍(lán)綠色而在365nm紫外燈照射下產(chǎn)熒光的菌落，這種類型的可疑菌落需進(jìn)行乙酰胺肉湯確證性實驗；

CN培養(yǎng)基上非藍(lán)綠色而在365nm紫外燈照射下產(chǎn)熒光的菌落

乙酰胺確證試驗

（3）是紅褐色菌落紫外燈照射下也不產(chǎn)熒光，需進(jìn)行氧化酶測試、乙酰胺液體培養(yǎng)基確證，金氏B培養(yǎng)基確證。

所有三種情況均需接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。

根據(jù)日常檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，前兩種的情況較多，第三種情況zui少，而第二種即非藍(lán)/綠色的產(chǎn)熒光的菌落zui具有迷惑性，也是檢驗的難點所在，需要特別仔細(xì)的進(jìn)行驗證。

典型菌落的形態(tài)周圍呈現(xiàn)融化的狀態(tài)，菌落數(shù)較少的情況下，劃線純化比較簡單；菌落數(shù)較多的情況劃線就比較麻煩了，因為第一種典型可疑菌落是直接目測能看到的，而第二種情況產(chǎn)熒光是需要在360nm的紫外燈照射下才能看見是否產(chǎn)熒光，這就會可能導(dǎo)致劃線純化的時候可疑和典型菌落出現(xiàn)混淆錯劃的情況，會導(dǎo)致結(jié)果的截然不同。例如：挑取藍(lán)綠色可疑菌落純化時，因菌落溶解狀擴(kuò)大，可能挑取時不僅挑取到了藍(lán)綠色可疑菌落，還挑取到其他類型可疑菌落，純化后確證就可能導(dǎo)致結(jié)果完全改變的情況，解決辦法是在這種菌落較多的情況下，可以采取計數(shù)后分開再在CN瓊脂平板上劃線一次，先在CN瓊脂平板上分離中上述幾種菌落的單個菌落，再劃線接種到營養(yǎng)瓊脂平板上純化后進(jìn)行確證試驗，已避免因挑取典型菌落出現(xiàn)差錯導(dǎo)致結(jié)果的偏差。

3 確證性試驗

這里需特別注意的是上述的第二種情況，即非藍(lán)/綠色產(chǎn)熒光的可疑菌落的產(chǎn)氨實驗：

純培養(yǎng)物接種到乙酰胺液體培養(yǎng)基36℃培養(yǎng)20～24h后，滴加1～2滴鈉氏試劑，檢查產(chǎn)氨實驗，有出現(xiàn)從深黃色到磚紅色的顏色變化，則為陽性，否則為陰性。

在實際過程中會發(fā)現(xiàn)確證試驗出現(xiàn)這種顏色變化過程的比例很高，是很多都是陽性結(jié)果

經(jīng)過使用生化試劑條鑒定發(fā)現(xiàn)有近六成的比例并不是銅綠假單胞菌，是什么原因呢，主要是時間的問題，時間比較久時，磚紅色出現(xiàn)的幾率比較高，會影響檢測人員的判斷，建議在3～5分鐘內(nèi)進(jìn)行觀察，并且一定要與陽性和陰性對照菌株進(jìn)行比較觀察，可有效降低誤判。另外推薦一種簡單的方法：如覺得還有疑問不能判定，可以從純培養(yǎng)物接種劃線到固體乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，銅綠假單胞菌在固體培養(yǎng)基上的特征是灰白色，扁平，邊緣不整齊，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，可以結(jié)合固體和液體培養(yǎng)基的生長特征和現(xiàn)象進(jìn)行判定，誤判基本可以消除，此方法成本很低，一般的生產(chǎn)企業(yè)可以使用。

銅綠假單胞菌的污染主要來自三個方面，一是水源的污染，二是加工過程的污染，三是包裝材料的污染，作為生產(chǎn)企業(yè)，需要通過提高自身的檢測能力，分別監(jiān)測這三個方面的污染情況，采取有效的消毒滅菌方式，并驗證滅菌效果，可確保生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量安全有保障。

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